Entres os times estreantes, está o Audax-Rio, clube de Angra dos Reis (RJ) que debutará na Copa do Brasil jogando em casa contra a Portuguesa-RJ, clube carioca da Ilha do Governador, bairro da zona norte da capital. Também haverá clássico tocantinense: o estreante Capital recebe o Tocantinópolis na primeira fase. Os demais estreantes são Água Santa, de Diadema (SP), Amazonas-AM, campeão da Série C do Brasileiro 2023; Manauara-AM; Olaria-RJ; Grêmio Atlético Sampaio-RR; Itabuna-BA; e Petrolina-PE.
Os dois vencedores de cada grupo da primeira fase (são ao todo 20, com quatro times cada) avançam à etapa seguinte, também eliminatória (jogo único). No entanto, no caso de empate, a definição da partida ocorrerá em cobrança de pênaltis. A partir da terceira fase, estarão juntos os times classificados e também os 2 clubes restantes: Palmeiras, Grêmio, Atlético-MG, Flamengo, Fluminense, São Paulo, Botafogo e RB Bragantino (representantes brasileiros na Copa Libertadores deste ano), além de Athletico-PR (nono lugar na Série A do Brasileirão 2023), Ceará (campeão da Copa do Nordeste), Goiás (campeão da Copa Verde) e Vitória (campeão da Série B).